Kurze hydrophobe Schleifenmotive in BRICHOS-Domänen bestimmen die Chaperonaktivität gegen die Aggregation amorpher Proteine, jedoch nicht gegen die Amyloidbildung

Jun 23, 2024

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 497 (2023) Diesen Artikel zitieren

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ATP-unabhängige molekulare Chaperone sind wichtig für die Aufrechterhaltung der zellulären Fitness, aber die molekularen Determinanten zur Verhinderung der Aggregation teilweise entfalteter Proteinsubstrate bleiben unklar, insbesondere im Hinblick auf den Assemblierungszustand und die Grundlage für die Substraterkennung. Die BRICHOS-Domäne kann abhängig von ihrem Assemblierungszustand und ihrer Reihenfolge kleine Hitzeschock-ähnliche Chaperonfunktionen (sHSP) in sehr unterschiedlichem Ausmaß ausführen. Hier haben wir drei hydrophobe Sequenzmotive in Chaperon-aktiven Domänen beobachtet und festgestellt, dass sie an der Oberfläche freigelegt werden, wenn sich die BRICHOS-Domäne zu größeren Oligomeren zusammenfügt. Studien zu Loop-Swap-Varianten und ortsspezifischen Mutanten zeigten außerdem, dass die biologischen Hydrophobizitäten der drei kurzen Motive linear mit der Effizienz zur Verhinderung der amorphen Proteinaggregation korrelieren. Gleichzeitig korrelieren sie überhaupt nicht mit der Fähigkeit, die Bildung geordneter Amyloidfibrillen zu verhindern. Die linearen Korrelationen sagen auch genau Aktivitäten von Chimären voraus, die kurze hydrophobe Sequenzmotive eines sHSP enthalten, das nichts mit BRICHOS zu tun hat. Unsere Daten zeigen, dass kurze, exponierte hydrophobe Motive, die durch Oligomerisierung zusammengebracht werden, für eine effiziente Chaperonaktivität gegen die Aggregation amorpher Proteine ​​ausreichend und notwendig sind.

Molekulare Chaperone spielen eine zentrale Rolle in der Proteostase-Maschinerie, indem sie die korrekte Faltung von Polypeptiden unterstützen1,2. Unter ihnen verhindern ATP-unabhängige molekulare Chaperone wie die kleinen Hitzeschockproteine ​​(sHSPs) toxische Folgen der Proteinaggregation, indem sie an ungefaltete oder fehlgefaltete Substrate binden und diese in einem löslichen, für die Rückfaltung kompetenten Zustand halten3,4. Bri2 ist ein Transmembranprotein vom Typ II, das allgegenwärtig exprimiert wird und dessen proteolytische Verarbeitung eine molekulare Chaperondomäne freisetzt – BRICHOS5,6. Interessanterweise sind andere molekulare Chaperone wie HSP60, HSP70 und HSP90 Teil des Bri2-Interaktoms im Gehirn und in der Netzhaut7,8. Die isolierte Bri2-BRICHOS-Domäne moduliert die Aggregationswege mehrerer Amyloid-bildender Substrate, verhindert Amyloid-assoziierte Toxizität und verhindert die Aggregation nichtfibrillärer, amorpher Proteine, ähnlich wie ATP-unabhängige molekulare Chaperone wie Kristalline oder Clusterin9,10,11,12, 13. Die Fähigkeit der Bri2-BRICHOS-Domäne, mit Substraten zu interagieren, die an Proteinaggregationsstörungen wie der Alzheimer-Krankheit14,15,16, Typ-II-Diabetes17 und der Parkinson-Krankheit18 beteiligt sind, unterstreicht ihre potenzielle Bedeutung für die zelluläre Proteostase.

Die BRICHOS-Domäne hat eine Größe von etwa 100 Aminosäureresten und liegt als Monomere oder Multimere vor, die von Dimeren bis hin zu großen polydispersen Oligomeren reichen, die durch kovalente und nichtkovalente Wechselwirkungen stabilisiert werden11,19,20. Die menschlichen Bri2- und Bri3-BRICHOS-Domänen bilden große Oligomere mit etwa 20–30 Untereinheiten, die die Aggregation amorpher Proteine ​​wirksam hemmen. Im Gegensatz dazu sind Bri2-BRICHOS-Monomere und -Dimere sowie die BRICHOS-Domäne des Prosurfactant-Proteins C (proSP-C), die hauptsächlich als Trimer vorliegt, alle inaktiv gegen die amorphe Proteinaggregation9,11,19,20. Die BRICHOS-Domänen aus verschiedenen Familien weisen geringe paarweise Sequenzidentitäten auf, aber Homologiemodelle des Bri2 BRICHOS-Monomers basierend auf der proSP-C BRICHOS-Kristallstruktur zeigen ein konserviertes zentrales fünfsträngiges β-Faltblatt, das von zwei über eine lange Verbindung verbundenen α-Helices flankiert wird flexible Schlaufe (Abb. 1a, b)19,20,21,22. Bisher gibt es für die Bri2-BRICHOS-Domäne keine experimentelle Struktur mit atomaren Details, was wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die Monomeruntereinheit konformativ dynamisch ist23 und dass die größeren Oligomere polydispers sind (siehe weiter unten).

eine einzelne Untereinheit aus der Kristallstruktur von wt proSP-C BRICHOS-Trimeren (PDB-Zugangsnummer: 2yad). Die gestrichelte Linie zeigt die Schleife an, die in der Kristallstruktur fehlt, und ihr Kernbereich ist mit einem blauen Schatten markiert. Die Sequenz ist in Schritten von blau für polare bis rot für hydrophobe Reste gekennzeichnet. b Wt Bri2 BRICHOS, modelliert durch AlphaFold 2, wobei der Schleifenkern wie in (a) beschriftet ist. c Aminosäuresequenzen menschlicher BRICHOS-Loop-Regionen (Ausrichtung siehe ergänzende Abbildung 1), farbcodiert wie in (a, b). Die hier untersuchten BRICHOS-Domänen sind fett gedruckt, die Motive 1–3 sind eingerahmt und T206 ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. d Schematische Modelle der Loop-Swap- und Delta-Loop-Varianten. e SEC der BRICHOS-Oligomervarianten (links) und geschätzte Anzahl der Untereinheiten (rechts). Die Anzahl der Untereinheiten wurde anhand der SEC-Peakmaxima geschätzt (angezeigt durch Mittellinien und Zahlen über den Kästchen) und die Kästchen stellen ihre volle Breite bei halbem Maximum dar.

Klassische ATP-unabhängige sHSP-Molekül-Chaperone wie αB-Kristallin bilden große polydisperse und dynamische Komplexe und können an eine Vielzahl von Proteinsubstraten binden3,10. Daten legen nahe, dass die strukturelle Plastizität ATP-unabhängiger molekularer Chaperone die Freilegung einzelner Bindungsregionen für entweder Amyloid- oder amorphe Klienten vermittelt. Während die Bindungsstellen für Amyloidsubstrate möglicherweise vom Substrat und der Art des fibrillären Aggregats abhängen24,25, scheinen die flexiblen und teilweise ungeordneten N-terminalen Domänen (NTDs) von sHSPs, die mit hydrophoben Resten angereichert sind, wichtig für die Bildung hochmolekularer Gewichtsanordnungen und Wechselwirkung mit amorph aggregierenden Modellsubstraten25,26,27,28,29.

In dieser Studie wollten wir die Architektur der Oligomere der Bri2-BRICHOS-Domäne verstehen und die Client-Bindungsstelle im Hinblick auf die Chaperonaktivität gegen die Aggregation amorpher Proteine ​​definieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass drei kurze hydrophobe Motive in einer unstrukturierten Schleife der Bri2-BRICHOS-Domäne die Schlüsselregion für die Stabilisierung teilweise entfalteter Substrate gegen amorphe Proteinaggregation darstellen, wichtig für die Oligomerplastizität sind, aber nicht die Fähigkeit zur Verzögerung der Amyloidbildung bestimmen.

Auf der Suche nach einer Erklärung für das unterschiedliche Verhalten menschlicher BRICHOS-Proteine ​​in Bezug auf die Aktivität zur Verhinderung der amorphen Proteinaggregation haben wir erkannt, dass die Schleife, die die α-Helices 1 und 2 verbindet, drei hydrophobe Tripeptidmotive in den Chaperon-aktiven Bri2- und Bri3-BRICHOS enthält. wohingegen die entsprechenden Motive im Chaperon-inaktiven proSP-C BRICHOS polar und geladen sind (Abb. 1a – c, ergänzende Abb. 1). Um zu testen, ob die Schleife die Fähigkeit definiert, Oligomere zu bilden und die Aggregation amorpher Proteine ​​zu verhindern, haben wir die Schleifen zwischen menschlichem Bri2 und proSP-C BRICHOS ausgetauscht und so LS-Varianten (Loop Swap) erzeugt (Abb. 1d). Bri2 BRICHOS aus Ictidomys tridecemlineatus (NCBI-Zugangsnummer: XP_013216182) und Octodon degus (NCBI-Zugangsnummer: XP_004633182) fehlt die gesamte Schleife, ist aber ansonsten fast identisch mit menschlichem Bri2 BRICHOS und wird hier als Delta-Loop (ΔL) Bri2 BRICHOS bezeichnet (Abb . 1c, d, Ergänzende Abb. 1). Rekombinantes LS und ΔL Bri2 BRICHOS weisen ähnliche Oligomerisierungsprofile bei der Größenausschlusschromatographie (SEC) und Gesamtsekundärstrukturen isolierter Oligomere, Dimere und Monomere auf wie die Wildtyp-(wt) menschlichen Bri2 BRICHOS-Gegenstücke11 (ergänzende Abbildung 2a – f). LS proSP-C BRICHOS bildet neben Trimeren und Monomeren, die für wt proSP-C BRICHOS19 beobachtet werden, große polydisperse disulfidverknüpfte Oligomere (ergänzende Abbildung 2g – i). LS Bri2-, LS proSP-C- und ΔL Bri2 BRICHOS-Oligomere haben insgesamt weniger Untereinheiten (ca. 12–24) als wt Bri2 BRICHOS-Oligomere (ca. 18–30) (Abb. 1e).

Als nächstes verfolgten wir die Aggregationskinetik der Modellsubstrate Citratsynthase (CS) und Rhodanese (Rho), die sich bei erhöhten Temperaturen in Abwesenheit und Anwesenheit oligomerer Fraktionen aller BRICHOS-Loop-Varianten entfalten und amorphe Aggregate bilden. LS Bri2 und ΔL Bri2 BRICHOS haben im Vergleich zu wt Bri2 BRICHOS deutlich reduzierte Aktivitäten sowohl gegen CS (Abb. 2a, b, ergänzende Abb. 3a, b) als auch gegen Rho (ergänzende Abb. 3c, d). Im Gegensatz dazu ist LS proSP-C BRICHOS genauso wirksam wie wt Bri2 BRICHOS bei der Verhinderung der amorphen Proteinaggregation, während wt proSP-C BRICHOS-Trimeren die Chaperonaktivität fehlt (Abb. 2a, b, ergänzende Abb. 3a – d)9. Die Analyse löslicher und unlöslicher Fraktionen von CS, nachdem die Aggregation ein Plateau erreicht hatte, bestätigte, dass Proteine, die die hydrophobe Bri2-BRICHOS-Schleife enthalten, das Substrat wirksamer in einem löslichen Zustand halten (Abb. 2c, d). LS Bri2 und ΔL Bri2 BRICHOS weisen in den Trübungsaggregationstests eine gewisse Restaktivität auf, insbesondere bei äquimolaren Verhältnissen zwischen CS und den BRICHOS-Proteinen (Abb. 2a, b, ergänzende Abb. 3a – d), sind jedoch überhaupt nicht in der Lage, CS im Inneren zu halten Lösung (Abb. 2c, d). Der Grund für diese Diskrepanz muss noch ermittelt werden, aber LS Bri2 und ΔL Bri2 BRICHOS könnten die Größe von CS- und Rho-Aggregaten beeinflussen und dadurch ihre Fähigkeit zur Lichtstreuung verringern. Um die Auswirkungen der Bri2-BRICHOS-Schleife auf die Fähigkeit, nichtfibrilläre Aggregation zu verhindern, weiter zu untersuchen, wurde ein Fusionsprotein hergestellt, das das Chaperon-inaktive Löslichkeits-Tag NT*30 und die isolierte Schleife (NT*-Schleife) enthielt. Bemerkenswerterweise können NT*-Loop-Oligomere (etwa 20 Untereinheiten, geschätzt von SEC) die CS-Aggregation um etwa 40 % reduzieren, während NT*-Loop-Monomere inaktiv sind (ergänzende Abbildung 3e). Auch wenn die Chaperon-Effizienz von NT*-Loop-Oligomeren geringer ist als bei wt-Bri2-BRICHOS-Oligomeren, deuten die Ergebnisse dennoch darauf hin, dass die Annäherung mehrerer Bri2-BRICHOS-Loops auf NT*-Loop-Oligomeren insgesamt die Chaperonaktivität fördert.

a Aggregationsspuren von 1,2 µmol L-1 CS bei 45 °C allein und mit den verschiedenen Schleifenvarianten im Molverhältnis 1:1 (CS: BRICHOS), farbcodiert wie in (b). Die Aggregationsspuren stammen aus 2–3 Replikaten. b Aggregationsmasse, bestimmt aus den Flächen unter den Kurven in (a). Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt und nur auf die Aggregationsmasse von CS normiert. c Mischungen von CS mit und ohne BRICHOS-Loop-Varianten nach Inkubation bei 45 °C oder nicht inkubierte frische Proben, analysiert durch SDS-PAGE. d Bandenintensitäten in (c), bewertet durch ImageJ50 und normalisiert auf die Bandenintensität von frischem CS.

Um zu bewerten, ob die Aktivität gegen die Amyloidbildung durch das Vorhandensein der Schleife beeinflusst wird, wurde Thioflavin T (ThT) verwendet, um die Kinetik der Aβ42-Fibrillenbildung zu verfolgen31. ΔL Bri2 BRICHOS hat unabhängig von seinem Montagezustand eine ähnliche Wirksamkeit gegen die Bildung von Aβ42-Fibrillen wie wt Bri2 BRICHOS-Monomere (ergänzende Abbildung 4a, b). Die globale kinetische Anpassung mikroskopischer Geschwindigkeitskonstanten 32, 33, 34 zeigte, dass die sekundäre Keimbildung und Verlängerung während der Aβ42-Fibrillenbildung in ähnlicher Weise durch ΔL Bri2 BRICHOS beeinflusst wird, wie für wt Bri2 BRICHOS gezeigt (ergänzende Abbildung 4c – e) 11, 15. Darüber hinaus wurden isolierte Bri2-BRICHOS-Schleifenmonomere, NT*-Schleifenmonomere oder -Oligomere auf Aβ42-Fibrillenbildung bei 37 ° C getestet, einer Temperatur, bei der die isolierte Schleife unstrukturiert und stabil ist (ergänzende Abbildung 3f). Die isolierten Loop- oder NT*-Loop-Monomere zeigten keine Fähigkeit, die Bildung von Aβ42-Fibrillen zu unterdrücken (ergänzende Abbildung 3g). NT*-Loop-Oligomere verzögerten die Bildung von Aβ42-Fibrillen leicht, der Effekt war jedoch nicht konzentrationsabhängig (ergänzende Abbildung 3h).

Bri2 BRICHOS-Oligomere, die zusammen mit CS bei erhöhter Temperatur inkubiert werden, bilden einen Komplex, der durch SEC isoliert werden kann (ergänzende Abbildung 5a). Die SDS-PAGE des durch SEC isolierten Komplexes zeigte zwei Banden, die CS bzw. rh Bri2 BRICHOS entsprachen, während die native PAGE nur eine Bande zeigte (ergänzende Abbildung 5b). Negativ gefärbte EM der Bri2-BRICHOS-Oligomere und des CS-Komplexes (ergänzende Abbildung 5c) zeigen Partikel, die sich strukturell von denen unterscheiden, die bei negativ gefärbtem EM von Bri2-BRICHOS-Oligomeren allein gesehen werden11. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Bri2-BRICHOS-Oligomere die amorphe Proteinaggregation verhindern können, indem sie Komplexe mit teilweise denaturierten Substraten bilden. Um die Lösungsmittelzugänglichkeit der Bri2 BRICHOS-Schleife in aktiven Oligomeren zu untersuchen, haben wir ein Reportersystem basierend auf Trp-Fluoreszenz entwickelt (Abb. 3a). Da Bri2 BRICHOS keine Trp-Reste enthält, haben wir Thr an Position 206, unmittelbar nach dem dritten hydrophoben Motiv in der Schleife, durch Trp (T206W) ersetzt (Abb. 3b). Bei Anregung bei 280 nm rh weisen Bri2 BRICHOS T206W-Oligomere ein Trp-Fluoreszenzemissionsmaximum bei 330 nm auf, während die Monomere ein Emissionsmaximum bei 323 nm aufweisen (Abb. 3a), was darauf hindeutet, dass die Mikroumgebung von Trp206 während des Übergangs von BRICHOS-Monomer zu Oligomer polarer wird Transformation. Diese Ergebnisse ermutigten uns, detaillierter zu untersuchen, inwieweit die hydrophoben Motive in der Bri2-BRICHOS-Schleife für ihre Chaperonfunktion entscheidend sind.

a Normalisierte Trp-Fluoreszenz für rh Bri2 BRICHOS T206W-Monomere und -Oligomere. b Aminosäuresequenzen der Mutanten der Schleifenmotive 1–3 (eingerahmt), siehe Abb. 1 für die gesamten Schleifensequenzen. c Aggregationsmasse von 1,2 µmol L−1 CS bei 45 °C in Abwesenheit oder Anwesenheit der verschiedenen Schleifenmutanten im Molverhältnis 1:1 (CS:BRICHOS). Die Aggregationsmasse stammt aus drei Replikaten. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt.

Wir haben eine Reihe von Bri2-BRICHOS-Mutanten mit dem Ziel erstellt, die Hydrophobie und Ladung der drei Tripeptidmotive in der Schleife zu modulieren (Abb. 3b). In vier Mutanten wurden die Reste in verschiedenen Tripeptidmotiven zu Glutaminsäure-Glycin-Arginin (EGR) mutiert (Abb. 3b), wie in Motiv 3 von Chaperon-inaktivem wt proSP-C BRICHOS (Abb. 1c, ergänzende Abb. 1). . Bei drei weiteren Mutanten werden hydrophobe Reste durch die polareren Reste Serin und Alanin (SS und SAS) ersetzt, und T206W ist im Gegensatz dazu hydrophober als das wt-Protein (Abb. 3b). Alle Mutanten bildeten Oligomere mit ähnlichen Sekundärstrukturen wie wt Bri2 BRICHOS, aber die durchschnittliche Größe aller mutierten Oligomere war etwas kleiner als die der wt-Oligomere (Ergänzende Abbildungen 6, 7). Mutanten, die weniger hydrophob sind als wt Bri2 BRICHOS, waren auch weniger wirksam bei der Hemmung der thermoinduzierten amorphen Aggregation von CS und Rho, während die hydrophobere T206W-Mutante eine leicht erhöhte Effizienz zeigte (Abb. 3c, ergänzende Abb. 8a, b).

Es besteht eine starke und signifikante lineare Korrelation zwischen der gesamten kombinierten Hydrophobie der drei Motive der Schleife und der Chaperonierungseffizienz gegenüber destabilisiertem CS und Rho (Abb. 4a, ergänzende Abb. 8c, d). Hier wurden Hydropathien anhand der „biologischen“ Hydrophobizitätsskala berechnet, die sich aus der Fähigkeit jedes Aminosäurerests ergibt, in die Lipidmembran des endoplasmatischen Retikulums eingefügt zu werden35. Die Verwendung der Kyte-Doolittle-Skala36 zur Beschreibung der Hydropathie der Motive führte zu qualitativ ähnlichen Korrelationen (ergänzende Abbildung 9). Dies legt nahe, dass Bri2-BRICHOS-Oligomere exponierte hydrophobe Regionen in den teilweise entfalteten Substraten hauptsächlich über drei kurze hydrophobe Motive erkennen, die durch kurze polare oder geladene Segmente getrennt sind. Da die Restzusammensetzung der Schleife auch den Grad der Oligomerassemblierung beeinflusst (Abb. 1e), korrelierten wir die aus SEC-Daten geschätzte Anzahl der konstituierenden Untereinheiten (ergänzende Abb. 7a) mit der Chaperonaktivität sowie mit der Hydrophobie der Schleifenmotive. Für die Aktivitäten gegen die Substrate CS und Rho besteht keine Korrelation zwischen der Anzahl der Untereinheiten in Oligomeren und der Chaperonaktivität (Abb. 4b, ergänzende Abb. 8e, f). Wenn dieselbe Analyse nur auf die Varianten beschränkt wird, die das Bri2-BRICHOS-Gerüst enthalten, also LS proSP-C BRICHOS weggelassen wird, besteht eine schwache Tendenz, dass größere Oligomere aktiver gegen CS sind (R2 = 0,5, p < 0,05), aber Für die Aktivität gegenüber Rho wurde noch keine Korrelation gefunden (R2 = 0,2, p = 0,19). Es wurde keine Korrelation zwischen den Motivhydropathien und der Anzahl der konstituierenden Untereinheiten der Chaperon-Oligomere festgestellt, obwohl alle mutierten Oligomere etwas kleinere Durchschnittsgrößen aufwiesen als das wt-Bri2-BRICHOS-Gegenstück (ergänzende Abbildung 8g). Während Bri2-BRICHOS-Monomere, -Dimere und -Tetramere gegenüber der amorphen Proteinaggregation völlig inaktiv sind, bestimmt die genaue Anzahl der Untereinheiten nicht die Aktivität größerer Oligomere (Abb. 4b, ergänzende Abb. 8e, f). In Übereinstimmung mit dieser Schlussfolgerung kann festgestellt werden, dass die circa 12-mere LS proSP-C BRICHOS-Oligomere genauso effizient sind wie wt Bri2 BRICHOS-Oligomere, die etwa die doppelte Anzahl an Untereinheiten aufweisen (Abb. 1e, 2b, d).

a, b Korrelationsanalyse zwischen der Aggregationsmasse und der Hydropathie der Motive 1–3 plus T206 oder W206, berechnet unter Verwendung der biologischen Hydrophobizitätsskala35 (a) und der Anzahl der Untereinheiten in Oligomeren, berechnet aus SEC-Daten in der ergänzenden Abbildung 7. (b). c Oberes Feld, Aminosäuresequenzen von Schleifen von wt Bri2, proSP-C und GKN2 BRICHOS und die ersten 18 Reste der NTD von αB-Kristallin (siehe ergänzende Abbildung 11a). Mittlere und untere Tafel, schematische Modelle der BRICHOS-Chimären αB Bri2 und αB proSP-C. d Lineare Regressionen der Beziehungen zwischen CS-Aggregationsmasse und Hydropathie, abgeleitet aus BRICHOS-Varianten bei 1:1 (Daten aus a, linkes Feld) oder 1:0,5 (Daten aus ergänzender Abbildung 8c) CS:BRICHOS-Verhältnisse, mit angegebenem 95 %-Konfidenzband durch gestrichelte Linien und Schatten. Experimentell bestimmte CS-Aggregationsmassen in Gegenwart von menschlichen GKN2 BRICHOS (grün), αB Bri2 (rot) oder αB proSP-C BRICHOS-Chimären (hellblau) (Rauten im Verhältnis 1:1, Kreise im Verhältnis 1:0,5), aufgetragen mit Fehlerbalken bei die für die jeweiligen kombinierten Motive 1–3 berechneten Hydropathiewerte (Sequenzen siehe (b)). e Die Aggregationsmassen von 1,2 µmol L−1 CS bei 45 °C mit und ohne unterschiedliche Konzentrationen von wt Bri2- und proSP-C BRICHOS-Domänenoligomeren und αB Bri2- und αB proSP-C BRICHOS-Chimärenoligomeren. Die Datenpunkte wurden an exponentielle oder lineare Abklingfunktionen angepasst. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. Aktivitäten von rekombinantem humanem αB-Kristallin aus Literaturwerten39,40,41 sind mit grauen Kreisen als Referenz dargestellt.

Alle Mutanten sowie ΔL Bri2 BRICHOS waren wirksam gegen die Bildung von Aβ42-Fibrillen, wenn auch in unterschiedlichem Maße (Ergänzende Abbildungen 4 und 10a – h). Es wurde keine Korrelation zwischen der Fähigkeit, die Halbwertszeit der Amyloidfibrillenbildung (τ1/2) zu verzögern, und (i) der Schleifenmotivhydropathie oder (ii) der Oligomergröße festgestellt (ergänzende Abbildung 10i, j). Dies deutet darauf hin, dass die Chaperonaktivität gegen die amorphe Proteinaggregation von BRICHOS-Oligomeren auf exponierten hydrophoben Regionen beruht, die gezielte Steuerung der Amyloidbildung jedoch auf anderen Prinzipien beruht. Diese Schlussfolgerung stimmt gut mit der jüngsten Erkenntnis überein, dass die Bindung von αB-Kristallin an α-Synuclein-Fibrillen über Monomere erfolgt und eher durch Entropie als durch Oligomere und hydrophobe Wechselwirkungen gesteuert wird38.

Als nächstes fragten wir, ob die Hydropathien von Kurzschleifenmotiven anderer ATP-unabhängiger molekularer Chaperone ihre Aktivitäten gegen die Aggregation amorpher Proteine ​​bestimmen. Aus den linearen Korrelationen zwischen der Hydrophobie des Schleifenmotivs und der Chaperonaktivität gegen amorphe Aggregation (Abb. 4a, ergänzende Abb. 8c) haben wir vorhergesagt, dass die BRICHOS-Domäne von menschlichem Gastrokin 2 (GKN2) (Abb. 1c, ergänzende Abb. 1) würde die CS-Aggregationsmasse auf 65 % (95 %-Konfidenzintervall (KI) 61–68 %) und 91 % (95 %-KI 84–97 %) bei einem Verhältnis von 1:1 bzw. 1:0,5 reduzieren (Abb. 4d). . Die entsprechenden experimentellen Ergebnisse für rekombinante wt-GKN2-BRICHOS-Oligomere betrugen 80 ± 1,2 % bzw. 96 ± 5,2 % (Abb. 4d). Die Vorhersagen aus diesen drei Schleifenmotiven sind überraschend genau, wenn man bedenkt, dass die gesamte paarweise Sequenzidentität zwischen den gesamten Bri2- und GKN2-BRICHOS-Domänen 20 % beträgt.

Um zu untersuchen, ob sich die Korrelation zwischen der Hydrophobie des Schleifenmotivs und der Chaperonaktivität auf sHSPs erstreckt, haben wir uns an αB-Kristallin gewandt. Die NTD des sHSP αB-Kristallins (auch HSPB5) ist teilweise ungeordnet, weist mehrere hydrophobe Motive auf und hat sich als wichtig für die Bindung amorpher Substrate erwiesen25. Wir haben einen Teil der Schleifen von wt Bri2 und wt proSP-C BRICHOS durch die N-terminalen achtzehn Reste von αB-Kristallin ersetzt. Dieses αB-Kristallin-NTD-Segment weist ein ähnliches hydrophobes Motivmuster wie die Schleife von wt Bri2 BRICHOS auf, jedoch keine Sequenzhomologie zu den Schleifen einer der BRICHOS-Domänen (Abb. 4c, ergänzende Abb. 11a). Die resultierenden αB Bri2- und αB proSP-C BRICHOS-Chimären (Abb. 4c) bilden große polydisperse Oligomere, etwa 12–26-mere bzw. 16–28-mere, und nehmen im Vergleich zu wt-Bri2-BRICHOS-Oligomeren insgesamt identische Sekundärstrukturen an (ergänzende Abb. 11b, c). Oligomere von αB Bri2- und αB proSP-C BRICHOS-Chimären sind ebenso wirksame Inhibitoren der amorphen Proteinaggregation wie wt humanes αB-Kristallin39, 40, 41 oder wt Bri2 BRICHOS, während wt proSP-C BRICHOS vollständig inaktiv ist (Abb. 4e). Interessanterweise stimmten für beide Chimären die Effizienzen gegen die Aggregation amorpher Proteine, die nur anhand der biologischen Hydrophobie der drei Motive im αB-Kristallin-NTD vorhergesagt wurden, unter Verwendung der aus unseren Daten abgeleiteten linearen Regression (Abb. 4a, ergänzende Abb. 8c) nahezu überein genau mit den entsprechenden experimentellen Daten (Abb. 4d).

Die hier präsentierten Daten zeigen, dass die Fähigkeit der Bri2-BRICHOS-Domäne, teilweise denaturierte Substratproteine ​​an der Bildung amorpher Aggregate zu hindern, stark mit der Hydrophobie von drei kurzen Motiven zusammenhängt, die sich in einer Schleifenregion befinden und von kurzen polaren Abschnitten durchsetzt sind. Dies legt nahe, dass direkte Wechselwirkungen zwischen exponierten hydrophoben Regionen in den teilweise denaturierten Substraten und den hydrophoben Schleifenmotiven des Chaperons für die Fähigkeit zur Unterdrückung der amorphen Aggregation von zentraler Bedeutung sind. Die Tatsache, dass monomeres, dimeres oder tetrameres Bri2 BRICHOS bei der Verhinderung der amorphen Proteinaggregation völlig inaktiv ist11,37 weist darauf hin, dass die Bildung größerer Oligomere unerlässlich ist. Wir fanden heraus, dass die Hydrophobie der drei kurzen Schleifenmotive letztendlich die Chaperonaktivität bestimmt, scheinbar indem sie die Affinität der Substratbindungsstelle sowie die quartäre Strukturanordnung in BRICHOS-Oligomeren definiert. Die wesentliche Bedeutung der Loop-Hydrophobie wurde vielleicht am deutlichsten durch Loop-Swaps von Bri2 BRICHOS bzw. αB-Crystallin zu proSP-C BRICHOS demonstriert, die im Gegensatz zu den im Wesentlichen völlig ineffizienten wt-proSP-Chaperonen zu hocheffizienten oligomeren Chaperonen führten. C BRICHOS-Trimere (Abb. 4e).

Es wird angenommen, dass molekulare Chaperone intrinsisch ungeordnete Regionen zur Erkennung einer Vielzahl fehlgefalteter Substrate nutzen. ATP-unabhängige molekulare Chaperone wie HSP33, HSP21 oder HdeA entfalten sich teilweise unter Stressbedingungen, um fehlgefaltete Clients effizient zu binden42,43,44. Es ist faszinierend, dass die hier als wesentlich für die Chaperonaktivität von Bri2-BRICHOS-Oligomeren ermittelten hydrophoben Motive in einer vermeintlich unstrukturierten Schleifenregion liegen. Die Schleifenkonfiguration und damit die freigelegten Bindungsstellen in einem Bri2-BRICHOS-Oligomer sind wahrscheinlich hochdynamisch und ermöglichen die Präsentation variabler Cluster hydrophober Reste, die zur Fähigkeit zur Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beitragen. Darüber hinaus ist die NTD innerhalb der sHSP-Familie in ihrer Sequenz und Länge sehr unterschiedlich, es hat sich jedoch gezeigt, dass sie der Schlüssel zu ihrer Fähigkeit ist, verschiedene Substrate zu binden25,28,45. Unsere Ergebnisse belegen nachdrücklich, dass die Freilegung flexibler ungeordneter hydrophober Bereiche und nicht die Sequenzidentität die Plastizität und Effizienz des Substrats gegen die Aggregation amorpher Proteine ​​vermittelt. Die Fähigkeit, Oligomere zu bilden und hydrophobe Motive freizulegen, wird von BRICHOS und Kristallinen gemeinsam genutzt, diese beiden Familien unterscheiden sich jedoch ansonsten strukturell. Wie hier gezeigt, muss BRICHOS größere Oligomere bilden, die hydrophobe Motive zusammenbringen und freilegen, um eine effiziente kanonische Chaperonaktivität zu erreichen, während Kristalline im Allgemeinen bei der Dissoziation in kleinere Untereinheiten aktiver werden27. Die scheinbar einfache Strategie, BRICHOS-Substrat-Wechselwirkungen durch Zusammenführung von Kurzschleifenmotiven zu ermöglichen, kann eine Möglichkeit sein, die Chaperonaktivität unter physiologischen Bedingungen zu regulieren,46 und die Mutagenese der BRICHOS-Domäne könnte eine Möglichkeit sein, neue Chaperonfunktionen zu erzeugen.

Alle Varianten der rekombinanten menschlichen Bri2 BRICHOS-Domäne (Reste 113 bis 231 von menschlichem Bri2 BRICHOS), LS Bri2 BRICHOS, ΔL Bri2 BRICHOS, die BRICHOS-Chimären αB Bri2 BRICHOS und αB proSP-C BRICHOS, die die Reste 1–18 von menschlichem αB Crystallin enthalten (HspB5, NCBI-Zugangsnummer: P02511) und die isolierte Bri2-BRICHOS-Schleife (Reste 187 bis 216 des menschlichen Bri2-Proteins) wurden in einen modifizierten pET32-Vektor kloniert, der den aus Spinnenseide stammenden His6-NT*-Tag30 enthielt, und verschiedene Assemblierungszustände wurden gereinigt11 . Menschliches proSP-C BRICHOS, entsprechend den Aminosäureresten 59–197, wurde hergestellt6 und Oligomere von LS proSP-C BRICHOS wurden durch Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung einer Superdex 200-Säule (GE Healthcare) als zusätzlicher letzter Schritt isoliert. Das Genfragment der menschlichen GKN2-BRICHOS-Domäne, das den Resten 21 bis 151 von menschlichem GKN2 entspricht, wurde in einen modifizierten pET32-Vektor kloniert, der den His6-NT*-Tag enthielt, und gemäß dem für Bri2 BRICHOS verwendeten Protokoll exprimiert und gereinigt. Mutationen wurden über PCR mit dem KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit (Kapa Biosystems, USA) eingeführt oder Konstrukte wurden von GenScript Biotech synthetisiert. Alle Sequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung (Eurofins Genomics) bestätigt. Die BRICHOS-Proteinkonzentrationen wurden durch Messung der Absorption bei 280 nm unter Verwendung der jeweiligen Extinktionskoeffizienten bestimmt. Alle angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf die Monomeruntereinheiten.

Zirkulardichroismus (CD)-Spektren wurden bei 25 °C in einem J-1500 CD-Spektrophotometer (JASCO) mit einem Peltier-Thermostatzellenhalter PTC-517 aufgezeichnet. Fünf oder 10 µmol L-1-Proteinproben wurden in 20 mmol L-1 NaPi, 0,2 mmol L-1 EDTA, pH 8,0 in einer Quarzglasküvette mit einer Weglänge von 1 mmol L-1 hergestellt. Es wurden fünf aufeinanderfolgende Scans pro Probe zwischen 180 und 260 nm mit einer Schrittweite von 0,5 nm aufgenommen. Gemittelte und vom Leerwert subtrahierte Spektren wurden in die mittlere Restelliptizität (MRE, deg cm2 dmol−1) umgewandelt.

Die analytische SEC wurde mit einer Superdex 200-Anstiegssäule und einer 500-µL-Probenschleife durchgeführt. 10 µmol L-1-Proteinproben wurden in 20 mmol L-1 NaPi, 0,2 mmol L-1 EDTA, pH 8,0 hergestellt und der gleiche Puffer wurde als SEC-Laufpuffer verwendet.

Für Tryptophan-Fluoreszenzmessungen wurden rekombinante Proteine ​​dreifach in 20 mM NaPi pH 8,0 mit 0,2 mM EDTA mit einem Volumen von 150 µL in schwarzen Polystyrol-Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen (Costar) hergestellt und bei 280 nm (5 mm Bandbreite) angeregt. . Die Fluoreszenzemission von 300–400 nm (10 mm Bandbreite, 1 nm Schrittintervall) wurde mit einem Spektrofluorometer (Tecan Saphire 2) aufgezeichnet. Die Daten wurden durch Subtrahieren der Hintergrundfluoreszenz (Puffer) korrigiert.

Die thermoinduzierte Aggregation von 0,6 µmol L-1 Schweineherz-Citrat-Synthase (CS) (Sigma-Aldrich, Deutschland) und 3 µmol L-1 Rinderleber-Rhodanese (Rho) (Merck; Darmstadt, Deutschland) wurde durch Messung der Absorption bei verfolgt 360 nm in 90-s-Zyklen während der Inkubation bei 45 °C mit einem POLARstar Omega-Plattenlesegerät (BMG Labtech, Offenberg, Deutschland). Die Proben wurden in schwarzen Polystyrol-96-Well-Halbflächenplatten mit klarem Boden (Corning Glass 3881, USA) vorbereitet und das Reaktantenvolumen betrug 100 µl. Stammlösungen der Modellsubstrate wurden entweder in 40 mmol L-1 HEPES/KOH, pH 7,5 (für CS) oder PBS, pH 7,4 (für Rho) hergestellt und in Puffer mit 40 mmol L-1 HEPES/KOH, pH, verdünnt 7,5 (für CS) oder PBS, pH 7,4 (für Rho). Die Proben wurden mit 20 mmol L-1 NaPi, 0,2 mmol L-1 EDTA, pH 8,0 für gleiche Pufferbedingungen von BRICHOS-Proteinen ergänzt. Die Messungen wurden dreifach durchgeführt und die Aggregationskinetik durch Integration der Fläche unter der Kurve analysiert, ausgedrückt als Aggregationsmasse, normalisiert auf die Aggregation von CS allein. Die angegebenen Molverhältnisse beziehen sich auf Monomere. Zur Komplexbildung wurden 0,6 µmol L−1 CS (Sigma-Aldrich, Deutschland) mit 6 µmol L−1 rh Bri2 BRICHOS-Oligomeren in 40 mmol L−1 HEPES/KOH pH 7,5 bei 45 °C unter Verwendung eines POLARstar Omega-Plattenlesegeräts inkubiert (BMG Labtech, Offenberg, Deutschland). Das Endprodukt wurde in eine Superose-6-Säule (Cytiva) injiziert und mit 20 mmol L-1 NaPi, pH 8,0, das 0,2 mmol L-1 EDTA enthielt, eluiert, und verschiedene Fraktionen wurden für die SDS-PAGE- und native PAGE-Analyse gesammelt. Der BRICHOS-CS-Komplex wurde auf kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter (400 Mesh, Analytical Standards) aufgetragen, mit 1 % Phosphorwolframsäure (PTA) negativ gefärbt und unter Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Jeol JEM2100F bei 200 kV) beobachtet.

Rekombinantes Aβ(1–42), hier als Aβ42 bezeichnet, wurde in Fusion mit dem NT*-Löslichkeits-Tag in BL21*(DE3)-E.-coli-Zellen hergestellt und das Fusionsprotein NT*-Aβ42 wurde durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) gereinigt )47. Gereinigtes NT*-Aβ42 wurde durch die Protease des Tabakätzvirus (TEV) über Nacht im Kühlraum gespalten, lyophilisiert und in 7 mol L−1 Gdn-HCl erneut aufgelöst. Die Aβ42-Monomere wurden in 20 mmol L-1 Natriumphosphat, pH 8,0, mit 0,2 mmol L-1 EDTA über eine Superdex 30-Säule (GE Healthcare, UK) isoliert. Die Konzentration des Monomers Aβ42 wurde unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1.424 M−1 cm-1 für (A280−A300) berechnet. Zur Aβ42-Fibrillenisierung wurden 20 µL Lösung mit 10 µmol L−1 ThT, 3 µmol L−1 Aβ42 Monomer und verschiedenen Konzentrationen der BRICHOS-Varianten in Molverhältnissen von 0, 10, 50 und 100 % (relativ zu Aβ42) zugegeben Vertiefungen von halbflächigen 384-Well-Mikrotiterplatten mit klarem Boden (Corning Glass 3766, USA) und bei 37 °C unter Ruhebedingungen inkubiert. Die ThT-Fluoreszenz wurde mit einem 440-nm-Anregungsfilter und einem 480-nm-Emissionsfilter unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (FLUOStar Galaxy von BMG Labtech, Offenberg, Deutschland) aufgezeichnet. Für alle Experimente wurden die Aggregationsspuren normalisiert und unter Verwendung von vier Wiederholungen gemittelt, und die Daten für eine Reihe von Experimenten wurden von derselben Platte aufgezeichnet.

Aggregationsprofile von Aβ42 in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von BRICHOS-Varianten wurden an eine empirische Sigmoidgleichung (Gl. (1))48,49 angepasst, und die Aggregationshalbzeit \({{\tau }}_{1/2} \) und die maximale Wachstumsrate \({r}_{\max }\) wurden extrahiert.

Dabei ist A die Amplitude und F0 der Basiswert.

Die Aggregationsspuren der gesamten Fibrillenmassenkonzentration M(t) werden durch das folgende integrierte Geschwindigkeitsgesetz32 beschrieben:

wobei die zusätzlichen Koeffizienten Funktionen von λ und κ sind:

Das sind zwei Kombinationen der mikroskopischen Geschwindigkeitskonstanten durch \(\lambda =\sqrt{2\cdot {k}_{+}{k}_{n}\cdot m{\left(0\right)}^{{ n}_{C}}}\) und \(\kappa =\sqrt{2\cdot {k}_{+}{k}_{2}\cdot m{\left(0\right)}^{ {n}_{2}+1}}\). Die mikroskopischen Geschwindigkeitskonstanten kn, k+ und k2 sind die Geschwindigkeitskonstanten der primären Keimbildung, der Dehnung bzw. der sekundären Keimbildung, und die Parameter nC und n2 sind die Reaktionsordnungen für die primäre bzw. sekundäre Keimbildung.

Wir haben die mikroskopischen Ereignisse, die durch BRICHOS-Varianten gehemmt werden, durch Anwendung von Gl. identifiziert. (2) zur Beschreibung der makroskopischen Aggregationsprofile. Die kinetischen Daten bei konstanter Aβ42-Konzentration mit unterschiedlichen BRICHOS-Konzentrationen wurden global analysiert, indem das kinetische Keimbildungsmodell angewendet wurde, wobei die Anpassung so eingeschränkt wurde, dass ein Anpassungsparameter über alle BRICHOS-Arten/-Variantenkonzentrationen hinweg auf einem konstanten Wert gehalten wurde, während der zweite Parameter dies war der einzige freie Parameter. Dieses Verfahren führt dazu, dass nur eine Geschwindigkeitskonstante, nämlich kn, k+ oder k2, der einzige Anpassungsparameter ist49.

Die Proteinaggregationsdaten zum Testen der Chaperonaktivitäten und die ThT-Fluoreszenzdaten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, und die Aggregationsspuren werden aus 3–4 Replikaten gemittelt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten und Materialien zu diesem Artikel sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Unbeschnittene Gelbilder sind als ergänzende Abbildung 12 enthalten. Die Rohdaten sind in ergänzenden Daten zusammengestellt.

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Die Autoren danken Stefan Knight und Wangshu Jiang für die Identifizierung und Klonierung der ΔL Bri2 BRICHOS-Domäne. Diese Studie wurde vom Swedish Research Council (JJ), der Swedish Brain Foundation (JJ) und dem Center for Innovative Medicine (CIMED) (JJ), dem Alzheimer's Association Research Grant (GC) und der Olle Engkvists Stiftelse (GC) unterstützt. , die Petrus und Augusta Hedlunds Stiftelse (GC, AA), die schwedische Alzheimer-Stiftung (GC), die Åhlén-stiftelsens (GC, AA), das Karolinska Institutet Research Foundation Grant (GC, AA), die Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor (GC, AA), die Loo and Hans Osterman Foundation (GC, AA), die Geriatric Diseases Foundation am Karolinska Institutet (GC, AA), die Gun and Bertil Stohne's Foundation (GC), Stiftelsen Sigurd och Elsa Goljes Minne (GC), Åke Wibergs stiftelse (GC, AA), Schwedische Gesellschaft für medizinische Forschung (AA), FORMAS (AA) und die Magnus Bergvall Stiftung (GC, AA). Dora Pluss-Programm finanziert vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung und der Republik Estland (HP).

Open-Access-Förderung durch das Karolinska-Institut.

Axel Leppert

Aktuelle Adresse: Abteilung für Mikrobiologie, Tumor- und Zellbiologie, Karolinska Institutet, 171 65, Solna, Schweden

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Gefei Chen, Axel Leppert.

Verstorben: Harriet E. Nilsson.

Abteilung für Biowissenschaften und Ernährung, Karolinska Institutet, 141 83, Huddinge, Schweden

Gefei Chen, Axel Leppert, Helen Poska, Carlos Piedrafita Alvira, Axel Abelein und Jan Johansson

Fakultät für Naturwissenschaften und Gesundheit, Universität Tallinn, Tallinn, Estland

Helen Poska

Fakultät für Ingenieurwissenschaften in Chemie, Biotechnologie und Gesundheit, Abteilung für Biomedizintechnik und Gesundheitssysteme, KTH Royal Institute of Technology, 141 52, Huddinge, Schweden

Harriet E. Nilsson, Xueying Zhong, Philip Koeck, Caroline Jegerschöld und Hans Hebert

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GC, AL, HP, HEN, CPA und XZ führten Experimente durch. GC, AL, HP, HEN, CPA, PK, CJ, AA, HH und JJ analysierten die Daten. GC, AL, AA und JJ konzipierten und gestalteten Experimente. JJ organisierte Forschung. GC, AL, HP und JJ haben den Artikel geschrieben. Alle Autoren kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Gefei Chen oder Jan Johansson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Dieses Manuskript wurde zuvor in einer anderen Nature Portfolio-Zeitschrift rezensiert. Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, G., Leppert, A., Poska, H. et al. Kurze hydrophobe Schleifenmotive in BRICHOS-Domänen bestimmen die Chaperonaktivität gegen die Aggregation amorpher Proteine, jedoch nicht gegen die Amyloidbildung. Commun Biol 6, 497 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04883-2

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Eingegangen: 07. Juli 2022

Angenommen: 27. April 2023

Veröffentlicht: 08. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04883-2

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